Сухая питательная среда Основа агара Хейфлика HiMedia ME1886-500G (уп/500 гр) производства HiMedia с конечным pH 7,8 ± 0,2. Основа предназначена для выявления микоплазм в фармацевтических образцах, вакцинах, клеточных банках и вирусных культурах и требует добавления восстановленной добавки Hayflick Supplement FD300 и 79 мл незапечённой сыворотки лошади.

Назначение

Основа агара Хейфлика HiMedia ME1886-500G рекомендована для выявления микоплазм в фармацевтических препаратах, вакцинах, клеточных банках и вирусных культурах в соответствии с требованиями Европейской фармакопеи (EP) и Фармакопеи США (USP).

Тип образца: фармацевтические образцы.

Состав

Формула скорректирована и стандартизирована в соответствии с параметрами эффективности.

Эквивалент: бульон на основе экстракта говяжьего сердца.

Эквивалент бульона на основе экстракта говяжьего сердца.

Методика приготовления среды

1. Суспендируйте 26,32 г сухой среды в 416 мл очищенной или дистиллированной воды.
2. Нагрейте до кипения для полного растворения среды.
3. Стерилизуйте в автоклаве при давлении 15 фунтов/дюйм² (≈0,10 МПа) и температуре 121 °C в течение 15 мин либо по валидированному циклу стерилизации.
4. Охладите приготовленную среду до 45–50 °C.
5. Добавьте 5 мл восстановленного содержимого одного флакона добавки Hayflick Supplement FD300.
6. Асептически добавьте 79 мл незапечённой сыворотки лошади RM1239.
7. Тщательно перемешайте и разлейте в стерильные чашки Петри либо используйте приготовленную среду другим необходимым способом.

Принцип действия и интерпретация

Микоплазмы представляют собой группу мелких бактерий класса Mollicutes, лишённых клеточной стенки. Микоплазмы вызывают серьёзное загрязнение клеточных и тканевых культур, используемых для получения фармакопейных препаратов, а также могут загрязнять стерилизованный фильтрованием соево-казеиновый питательный бульон.

Инфицирование клеток в культуре может влиять практически на все метаболические пути, включая изменение фенотипических характеристик клеток и их нормального роста. Наличие микоплазм не всегда приводит к помутнению культур или видимому изменению клеток.

Для роста микоплазм применяются сложные питательные среды, описанные Хейфликом и соавторами. Исследование на микоплазмы необходимо для подтверждения чистоты биотехнологических продуктов и связанных с ними материалов, используемых при производстве этих продуктов. Твёрдая среда Hayflick Agar рекомендована фармакопеями для общего выявления микоплазм при контроле продукции на наличие микоплазм.

При каждом исследовании на микоплазмы необходимо включать не менее двух известных видов или штаммов микоплазм в качестве положительных контролей:

• один контроль должен быть ферментирующим декстрозу — например, Mycoplasma pneumoniae либо эквивалентный вид и штамм;
• один контроль должен быть гидролизующим аргинин — например, Mycoplasma orale либо эквивалентный вид и штамм.

При исследовании клеточных линий насекомых дополнительно следует включать контрольный штамм Spiroplasma, например Spiroplasma citri ATCC 29747, Spiroplasma melliferum ATCC 29416 либо эквивалентный вид и штамм. Такие штаммы могут предъявлять более высокие требования к составу питательной среды и требуют более низкой температуры инкубации, как и клеточные линии насекомых.

Компоненты среды выполняют следующие функции:

• BI-бульон, содержащий инфузионный порошок HM и пептон, обеспечивает источники азота, витаминов, аминокислот и углерода.
• Хлорид натрия поддерживает осмотический баланс.
• Для нормального роста многим микоплазмам необходима сыворотка.
• Добавление пенициллина подавляет рост нежелательной микрофлоры.
• Феноловый красный указывает на рост микоплазм по изменению цвета среды с красного на жёлтый или пурпурный.
• Сыворотка лошади обеспечивает микоплазмы факторами роста, включая липидные компоненты.
• ДНК служит дополнительным источником питательных веществ.
• Дрожжевой экстракт является богатым источником никотинамид-адениндинуклеотида (NAD), необходимого для Mycoplasma synoviae.
• Агар выполняет функцию отверждающего компонента.

Виды микоплазм могут быть аэробными или факультативно-анаэробными; некоторые виды являются микроаэрофильными. Отдельные анаэробные сапрофитные микоплазмы лучше всего растут при 22–35 °C, тогда как патогенные штаммы растут при 35 °C.

Пробирки следует инкубировать в атмосфере, содержащей 5–10 % углекислого газа, и исследовать после 48 ч инкубации. Пробирки нельзя считать отрицательными и утилизировать до завершения инкубации в течение 3 недель.

Mycoplasma synoviae не способна расти на бульонной среде Hayflick, поскольку рост зависит от NAD. Штамм Mycoplasma hyorhinis ATCC 29052, рекомендованный в качестве требовательного штамма для использования в методе с индикаторными клетками, на этой среде не растёт.

Подготовка и обработка образцов

Для выявления микоплазм рекомендуется периодически пересевать рост, полученный в жидкой среде Hayflick Broth ME1885, на твёрдую среду Hayflick Agar ME1886.

1. Внесите 10 мл исследуемого продукта в 100 мл бульона Hayflick ME1885.
2. Инкубируйте пересевы в течение 7 суток в микроаэрофильных условиях при 35–37 °C.
3. На 2–4-е, 6–8-е, 13–15-е и 19–21-е сутки после инокуляции выполняйте пересев жидкой среды Hayflick Broth ME1885 как минимум на одну чашку каждого типа агара Hayflick ME1886.
4. Инкубируйте чашки в течение 7 суток в микроаэрофильных условиях при 35–37 °C.
5. Дополнительно внесите по 0,2 мл исследуемого продукта непосредственно на каждую чашку с агаром Hayflick ME1886.
6. Инкубируйте чашки не менее 14 суток в микроаэрофильных условиях при 35–37 °C, при концентрации CO₂ 5–10 % и достаточной влажности.
7. Обязательно выполните положительный и отрицательный контроль.
8. В соответствии с рекомендациями Европейской фармакопеи исследуйте твёрдые среды на наличие типичных колоний Mycoplasma.

Ограничения метода

1. Чашки следует инкубировать в атмосфере, содержащей 5–10 % углекислого газа, и исследовать через 48 ч. Чашки нельзя считать отрицательными и утилизировать до завершения инкубации в течение 3 недель.
2. Для подтверждения результата необходимо выполнить дополнительные биохимические тесты.

Контроль качества

Внешний вид: однородный сыпучий порошок светло-жёлтого или розового цвета.

Гелеобразование: плотный гель, сопоставимый с 1,5 % агаровым гелем.

Цвет и прозрачность приготовленной среды: оранжево-розовый прозрачный или слегка опалесцирующий гель, образующийся в чашках Петри после добавления добавки FD300 и сыворотки лошади RM1239.

Реакция: реакция 5,26 % масс./об. водного раствора при 25 °C; pH 7,8 ± 0,2.

Диапазон pH: 7,60–8,00.

Культуральные характеристики

Культуральные характеристики определены после добавления стерильной добавки FD300 и сывор