Основа бульона Хейфлика HiMedia ME1885-500G (уп/500 гр)

Питательная среда — основа бульона Хейфлика HiMedia ME1885-500G (уп/500 гр) — порошковая основа для приготовления жидкой среды. Предназначена для выявления микоплазм в фармацевтических препаратах, вакцинах, банках клеток и вирусных культурах; готовая среда требует добавления добавки Хейфлика FD300 и лошадиной сыворотки RM1239.

Назначение

Основа бульона Хейфлика применяется для приготовления жидкой питательной среды при выявлении микоплазм в фармацевтических образцах, вакцинах, банках клеток и вирусных культурах в соответствии с методиками Европейской фармакопеи (EP) и Фармакопеи США (USP).

Среда эквивалентна бульону с сердечным экстрактом говядины.

Состав

Формула скорректирована и стандартизирована для обеспечения заданных рабочих параметров.

Технические характеристики

• Производитель: HiMedia
• Назначение изделия: основа
• Тип продукта: стандартный
• Форма выпуска: порошок
• Тип упаковки: полиэтилен высокой плотности (HDPE)
• Происхождение компонентов: животное
• Масса упаковки: 500 г
• Конечный pH при 25 °C: 7,8 ± 0,2

Приготовление среды

1. Приготовьте суспензию из 18,82 г порошка в 416 мл очищенной или дистиллированной воды.
2. Нагрейте суспензию до кипения для полного растворения среды.
3. Простерилизуйте среду в автоклаве при давлении 15 фунтов, ориентировочно 0,103 МПа, и температуре 121 °C в течение 15 мин либо используйте валидированный цикл стерилизации.
4. Охладите среду до 45–50 °C.
5. Добавьте 5 мл восстановленного содержимого одного флакона добавки Хейфлика FD300.
6. В асептических условиях добавьте 79 мл не нагретой лошадиной сыворотки RM1239.
7. Тщательно перемешайте и разлейте среду в стерильные пробирки либо используйте по назначению.

Принцип действия и интерпретация

Микоплазмы относятся к классу Mollicutes и представляют собой мелкие бактерии, лишённые клеточной стенки. Они являются распространёнными загрязнителями клеточных и тканевых культур, используемых для получения фармакопейной продукции, и могут загрязнять стерилизованный фильтрованием соево-казеиновый бульон.

Инфицирование клеток в культуре способно влиять практически на все пути клеточного метаболизма, включая изменение фенотипических характеристик клеток и их нормального роста. Присутствие микоплазм не всегда сопровождается помутнением культуры или видимым изменением клеток.

Хейфлик и соавторы описали сложные среды для выращивания микоплазм. Исследование на микоплазмы необходимо для подтверждения чистоты биотехнологической продукции и вспомогательных материалов, используемых при её производстве. Жидкий бульон Хейфлика рекомендован фармакопейными методиками для общего выявления микоплазм в исследуемой продукции.

При каждом испытании на микоплазмы следует включать не менее двух известных видов или штаммов микоплазм в качестве положительных контролей:

• один контроль должен ферментировать декстрозу, например Mycoplasma pneumoniae или эквивалентный вид и штамм;
• один контроль должен гидролизовать аргинин, например Mycoplasma orale или эквивалентный вид и штамм.

При исследовании линий клеток насекомых дополнительно следует включать контрольный штамм Spiroplasma, например Spiroplasma citri ATCC 29747, Spiroplasma melliferum ATCC 29416 либо эквивалентный вид и штамм. Эти штаммы могут предъявлять более высокие требования к питательным веществам и нуждаться в более низкой температуре инкубации, как и линии клеток насекомых.

Бульон BI содержит инфузионный порошок HM и пептон, обеспечивающие источники азота, витаминов, аминокислот и углерода. Хлорид натрия поддерживает осмотический баланс. Для полноценного роста многим микоплазмам необходима сыворотка. Добавление пенициллина подавляет рост нежелательной микрофлоры. Феноловый красный указывает на рост микоплазм изменением цвета среды с красного на жёлтый или пурпурный. Лошадиная сыворотка обеспечивает факторы роста, включая липидные компоненты. ДНК служит дополнительным источником питательных веществ. Дрожжевой экстракт является богатым источником никотинамидадениндинуклеотида (НАД), необходимого для роста Mycoplasma synoviae.

Виды Mycoplasma могут быть аэробными или факультативно-анаэробными, а некоторые — микроаэрофильными. Некоторые сапрофитные анаэробные микоплазмы лучше растут при 22–35 °C, тогда как патогенные штаммы растут при 35 °C.

Пробирки следует инкубировать в атмосфере, содержащей 5–10 % CO₂, и исследовать через 48 ч после начала инкубации. Пробирки нельзя считать отрицательными и утилизировать до завершения инкубации в течение трёх недель.

Mycoplasma synoviae не растёт на бульоне Хейфлика, поскольку её рост зависит от НАД. Mycoplasma hyorhinis ATCC 29052, рекомендованная в качестве требовательного штамма для использования в методе с индикаторными клетками, также не растёт на этой среде.

Исследуемый материал

• Тип образца: фармацевтические образцы

Отбор и обработка образцов

1. Внесите 10 мл исследуемого продукта в 100 мл бульона Хейфлика.
2. Плотно закройте флаконы и инкубируйте 20–21 сутки при 35–37 °C.
3. Контролируйте флаконы каждые 2–3 суток.
4. При изменении цвета среды выполните пересев.
5. Инкубируйте пересевы 7 суток в микроаэрофильных условиях при 35–37 °C.
6. На 2–4-е, 6–8-е, 13–15-е и 19–21-е сутки после внесения образца выполняйте пересев жидкой среды как минимум на одну чашку каждого типа агара Хейфлика ME1886.
7. Инкубируйте чашки 7 суток в микроаэрофильных условиях при 35–37 °C.
8. Дополнительно внесите по 0,2 мл исследуемого продукта непосредственно на каждую чашку с агаром Хейфлика ME1886.
9. Инкубируйте чашки не менее 14 суток в микроаэрофильных условиях при 35–37 °C, при содержании CO₂ 5–10 % и достаточной влажности.
10. Обязательно выполните положительный и отрицательный контроль.
11. В соответствии с рекомендациями EP осмотрите твёрдые среды на наличие типичных колоний микоплазм.
12. После использования загрязнённые материалы простерилизуйте в автоклаве перед утилизацией.

Ограничения применения

• Пробирки следует инкубировать в атмосфере, содержащей 5–10 % CO₂, и исследовать через 48 ч после начала инкубации.
• Пробирки нельзя считать отрицательными и утилизировать до завершения инкубации в течение трёх недель.
• Mycoplasma synoviae не способна расти на бульоне Хейфлика из-за зависимости роста от НАД.
• Mycoplasma hyorhinis ATCC 29052 не способна расти на этой среде.

Контроль качества

Внешний вид

Однородный, легко сыпучий порошок от светло-жёлтого до розового цвета.

Цвет и прозрачность приготовленной среды

Прозрачный раствор оранжево-розового цвета без осадка после добавления добавки FD300 и лошадиной сыворотки RM1239 в пробирки.

Реакция

Реакция водного раствора с массово-объёмной концентрацией 3,76 % при 25 °C.

• pH: 7,8 ± 0,2
• Диапазон pH: 7,60–8,00

Культуральные характеристики

Культуральные характеристики оценивают после добавления стерильной добавки FD300 и лошадиной сыворотки RM1239 в присутствии 10 % углекислого газа (CO₂), после инкубации при 35–37 °C в течение не более 7 суток.

Условия хранения и срок годности

• Температура хранения сухого продукта: 10–30 °C
• Условия хранения сухого продукта: в плотно закрытой ёмкости
• Температура хранения приготовленной среды: 2–8 °C
• Срок использования: до даты окончания срока годности, указанной на этикетке
• После вскрытия плотно закрывайте флакон и храните продукт в сухом виде.
• Порошок гигроскопичен; неправильное хранение может привести к образованию комков.
• Храните продукт в сухом вентилируемом помещении, защищённом от экстремальных температур и источников воспламенения.
• После каждого использования плотно закры