Основа агара для Clostridium perfringens HiMedia M837I-100G предназначена для количественного определения Clostridium perfringens в пищевых продуктах и кормах. Состав и критерии эффективности среды соответствуют спецификациям стандарта ISO 7937:2004.
Принцип измерения
Среда основана на рецептуре триптозо-сульфит-циклосеринового агара (TSC). Триптоза, соевый пептон и дрожжевой экстракт обеспечивают азот- и углеродсодержащие соединения, длинноцепочечные аминокислоты, витамины комплекса B и микроэлементы, необходимые для роста клостридий. Метабисульфит натрия и цитрат аммония железа(III) служат индикаторами восстановления сульфита, что проявляется в виде образования колоний чёрного цвета. D-циклосерин (добавляется отдельно) обеспечивает селективность, подавляя рост сопутствующей микрофлоры и других факультативных анаэробов.
Методика проведения анализа
Подготовка среды
- Суспендируйте 21,0 г порошка в 500 мл очищенной или дистиллированной воды.
- Нагрейте до кипения для полного растворения компонентов.
- Стерилизуйте в автоклаве при температуре 121 °C (давление ≈0,1 МПа / 15 psi) в течение 15 минут.
- Охладите до 45–50 °C и добавьте содержимое одной ампулы селективной добавки T.S.C. (FD014). При необходимости использования флуоресцентного детектирования добавьте селективную добавку CMF (FD243).
- Тщательно перемешайте перед разливом в стерильные чашки Петри.
Посев и инкубация
- В чашку Петри влейте 10–15 мл агара T.S.C., поддерживаемого при температуре 44–47 °C на водяной бане.
- Внесите инокулят, аккуратно вращая чашку для равномерного перемешивания.
- После застывания среды нанесите поверхный слой из 10 мл того же агара T.S.C.
- После окончательного застывания поместите чашки в контейнеры с модифицированной атмосферой или другие подходящие сосуды.
- Инкубируйте в анаэробных условиях при 37 °C в течение 20 ± 2 ч. (Длительная инкубация может привести к избыточному почернению среды).
Подсчёт и отбор колоний
- Выберите чашки, содержащие менее 150 колоний (по возможности из последовательных разведений).
- Подсчитайте характерные колонии предполагаемых C. perfringens.
- Выберите пять характерных колоний для биохимического подтверждения.
Биохимическое подтверждение
Вариант I: Использование лактозно-сульфитного бульона (M1287)
- Инокуляция: Посейте выбранную колонию в среду Fluid Thioglycollate Medium (M009). Инкубируйте в анаэробе при 37 °C 18–24 ч.
- Перенос: Перенесите 5 капель культуры в лактозно-сульфитный бульон (M1287) стерильной пипеткой.
- Инкубация: Инкубируйте аэробно при 46 °C в водяной бане 18–24 ч.
- Интерпретация: Положительным считается результат при наличии чёрного осадка (сульфит железа) и заполнении трубки Дюрана газом более чем на 1/4. При сомнениях процедуру с переносом в новую пробирку повторяют.
Вариант II: Использование буферизированной нитратно-подвижной среды (M6301) и модифицированной лактозно-желатиновой среды (M9871)
- Нитратно-подвижная среда (M6301):
- Выполните укольный посев колонии в деаэрированную среду M6301. Инкубируйте в анаэробе при 37 °C 24 ч.
- Оцените подвижность (диффузный рост от линии укола).
- Добавьте 0,2–0,5 мл реагента для обнаружения нитритов. Появление красного цвета подтверждает восстановление нитрата до нитрита. Если цвет не появился за 15 мин, добавьте немного цинковой пыли; появление красного цвета после этого означает отсутствие восстановления нитрата.
- Лактозно-желатиновая среда (M9871):
- Посейте колонию в деаэрированную среду M9871. Инкубируйте в анаэробе при 37 °C 24 ч.
- Оцените наличие газа и жёлтого окрашивания (ферментация лактозы).
- Охладите пробирки при 5 °C в течение 1 ч для проверки разжижения желатина. Если среда осталась твердой, повторно инкубируйте 24 ч.
Итоговая интерпретация: Бактерии, образующие чёрные колонии на T.S.C., неподвижные, восстанавливающие нитрат до нитрита, ферментирующие лактозу с образованием кислоты и газа, а также разжижающие желатин за 48 ч, считаются C. perfringens.
Технические характеристики
Состав (ISO Specification-Perfringens Agar Base T.S.C.)
| Компонент | г/л |
|---|
| Энзимный гидролизат белка | 15,000 |
| Энзимный гидролизат сои | 5,000 |
| Дрожжевой экстракт | 5,000 |
| Дисульфит натрия (Na₂S₂O₅), безводный | 1,000 |
| Цитрат аммония железа(III) | 1,000 |
| Агар | 9,000–18,000 |
| Конечный pH (при 25 °C) | 7,6 ± 0,2 |
Состав (Perfringens Agar Base T.S.C. M8371)
| Компонент | г/л |
|---|
| Триптоза | 15,000 |
| Соевый пептон | 5,000 |
| Дрожжевой экстракт | 5,000 |
| Метабисульфит натрия | 1,000 |
| Цитрат аммония железа | 1,000 |
| Агар | 15,000 |
| Конечный pH (при 25 °C) | 7,6 ± 0,2 |
Селективные добавки (после автоклавирования)
| Добавка | г/л |
|---|
| D-циклосерин | 0,400 |
Состав селективной добавки T.S.C. (FD014):
- D-циклосерин: 200 мг (2 флакона).
Общие параметры
| Параметр | Значение |
|---|
| Происхождение | Животное |
| Тип продукта | Стандартный |
| Физическая форма | Порошок |
| Тип упаковки | ПНД (HDPE) |
| Внешний вид | Гомогенный свободнотекущий порошок от светло-жёлтого до коричнево-жёлтого цвета |
| Желирование | Плотное, сопоставимо с 1,5% агаровым гелем |
| Реакция (4,2% р-р при 25 °C) | pH: 7,6 ± 0,2 |
| Диапазон pH | 7,40–7,80 |
Культуральные характеристики
Характеристики определены в анаэробной атмосфере с добавлением селективной добавки T.S.C. (FD014) после инкубации при 37 ± 1 °C в течение 20 ± 4 – 44 ± 4 ч. Скорость восстановления считается 100 % для роста бактерий на референтной среде (соево-казеиновый дигест-агар).
| Организм | Посевная доза (КОЕ) | Рост | Восстановление | Характерная реакция |
|---|
| Продуктивность | | | | |
| Clostridium perfringens ATCC 13124 (00007) | 50–100 | обильный | ≥50 % | Чёрные колонии |
| Clostridium perfringens ATCC 12916 (00080) | 50–100 | обильный | ≥50 % | Чёрные колонии |
| Селективность | | | | |
| Escherichia coli ATCC 25922 (00013*) | ≥10⁴ | подавлен | | |
| Escherichia coli ATCC 8739 (00012*) | ≥10⁴ | подавлен | | |
Условия эксплуатации и хранения
- Температура хранения: 10–30 °C в плотно закрытом контейнере.
- Хранение готовой среды: 2–8 °C.
- Особенности: Продукт гигроскопичен; после вскрытия флакон необходимо плотно закрыть для предотвращения образования комков. Хранить в сухом вентилируемом помещении, вдали от источников возгорания и экстремальных температур.
Ограничения и предостережения
- Индивидуальные организмы могут иметь различные требования к росту и демонстрировать вариативность паттернов роста на данной среде.
- Рекомендуется валидация среды для конкретных микроорганизмов, не указанных в сертификате анализа (COA).
- В некоторых случаях может потребоваться предварительное обогащение (например, в среде с вареным мясом M149).
- При работе с образцами и культурами следует соблюдать стандартные правила микробиологической безопасности и использовать средства индивидуальной защиты (перчатки, одежда, защита глаз и лица).
