HiMedia M239-100G Основа среды для лептоспир, Флетчер

Основа сухой питательной среды для лептоспир по Флетчеру HiMedia M239-100G. Рекомендуется для изоляции, культивирования и поддержания жизнеспособности видов Leptospira; вес упаковки 100 г.

Принцип измерения

Лептоспиры представлены как свободноживущими, так и паразитическими формами (патогенные виды определяются как Leptospira interrogans). Из-за малого размера микроорганизмы трудно обнаружить в нативных препаратах свежей крови. Наиболее достоверным методом лабораторной диагностики лептоспироза является культивирование возбудителя из крови или спинномозговой жидкости (в первую неделю заболевания) либо из мочи (в течение нескольких последующих месяцев).

Среда содержит пептон и HM-пептон B, обеспечивающие необходимый набор питательных веществ для роста бактерий. Хлорид натрия обеспечивает поступление основных ионов. Дополнительная обогащающая добавка служит источником углерода, витаминов и энергии. Низкая концентрация агара способствует выявлению подвижности микроорганизмов.

При обогащении среды сывороткой кролика в состав попадает нативный гемоглобин, который совместно с тиамином стимулирует рост лептоспир.

Методика проведения анализа

Подготовка среды

1. Растворить 2,5 г основы в 920 мл очищенной или дистиллированной воды (объем воды должен быть скорректирован с учетом последующего добавления обогатителя).
2. Нагреть до кипения для полного растворения компонентов.
3. Стерилизовать в автоклаве при температуре 121 °C (давление $\approx$0,1 МПа) в течение 15 минут.
4. Охладить до 45–50 °C.
5. В асептических условиях добавить 80 мл стерильного обогатителя для лептоспир (сыворотка кролика или лошади, например, RM1239), чтобы довести конечный объем до 1 литра.
6. Разлить по пробиркам.

Посев и инкубация

1. В среду Флетчера инокулируют несколько капель крови с гепарином или хлоридом натрия в качестве антикоагулянта.
2. Культуры инкубируют при комнатной температуре в темноте до 6 недель.
3. Организмы растут ниже поверхности среды.

Оценка результатов

1. Еженедельно исследовать материал, взятый на несколько сантиметров ниже поверхности среды, с помощью прямого влажного препарата под темнопольным микроскопом. Лептоспиры характеризуются специфической «штопореподобной» подвижностью.
2. Проверять пробирки на наличие роста каждые 5–7 дней. Рост проявляется в виде кольцевой зоны (диска) на глубине 1–3 см от поверхности среды.
3. Отсутствие кольцевой зоны не всегда означает отсутствие лептоспир.
4. Для микроскопии рекомендуется зафиксировать микроколонии из зоны диска метанолом и окрасить по Гимзе для визуализации палочковидных форм (окраска по Грамму неэффективна).

Технические характеристики

Состав (г/л)

Конечный pH (при 25 °C): 7,9 $\pm$ 0,2. Формула стандартизирована для обеспечения заданных рабочих параметров.

Общие параметры

Контроль качества

• Внешний вид: белый или желтоватый гомогенный свободнотекущий порошок.
• Желирование: полутвердый гель, сопоставимый с 0,15% агаровым гелем.
• Цвет и прозрачность готовой среды: очень светло-желтый, слегка опалесцирующий гель.
• Реакция: pH 7,9 $\pm$ 0,2 (для 0,25% водного раствора при 25 °C).
• Диапазон pH: 7,70–8,10.

Культуральные характеристики

Характеристики наблюдались при добавлении стерильного обогатителя для лептоспир (сыворотка кролика/лошади RM1239) после инкубации при 30–32 °C в течение 5 суток.

Область применения

Среда используется для работы с клиническими образцами:

• Кровь или спинномозговая жидкость (в первую неделю заболевания).
• Моча (в последующий период).

Условия эксплуатации и хранения

• Хранение основы: в плотно закрытом контейнере при температуре 10–30 °C в сухом вентилируемом месте, вдали от источников возгорания.
• Хранение готовой среды: при температуре 2–8 °C.
• Особенности: продукт гигроскопичен; после вскрытия флакон необходимо плотно закрывать во избежание комкования.

Ограничения и предупреждения

• Ограничения: лептоспиры могут выделяться спорадически, поэтому посев последовательных образцов с интервалом минимум в 1 день повышает вероятность получения положительного результата. Различные штаммы могут демонстрировать разный характер роста.
• Меры предосторожности: только для диагностики in vitro и профессионального использования. При работе с клиническими образцами использовать средства индивидуальной защиты (перчатки, одежда, защита глаз и лица) и соблюдать стандартные микробиологические правила работы с инфекционным материалом.
• Утилизация: загрязненные материалы подлежат обязательному автоклавированию или сжиганию перед утилизацией.