G418 disulfate salt HiMedia TC025-5G (5 г)

Реактив для культур клеток G418 disulfate salt HiMedia TC025-5G (5 г) — аминогликозидный антибиотик для селекции эукариотических клеток. Применяется для отбора стабильных трансфектантов с геном устойчивости neo и поддержания фенотипа устойчивости neor; рабочую концентрацию определяют отдельно для каждой клеточной линии.

Идентификация и состав

Принцип действия и назначение

Генетицин (G418) — аминогликозидный антибиотик, структурно сходный с гентамицином; продуцируется микроорганизмом Micromonospora rhodorangea. Препарат широко применяют для селекции эукариотических клеток, стабильно трансфицированных генами устойчивости к неомицину (neo), а также для поддержания фенотипа устойчивости neor.

Генетицин подавляет синтез полипептидов, необратимо связываясь с рибосомами 80S и ингибируя удлинение белковой цепи в прокариотических и эукариотических клетках. Активность антибиотика могут инактивировать бактериальные аминогликозидфосфотрансферазы APH(3')II и APH(3')I, кодируемые генами транспозонов Tn5 и Tn601 (903) соответственно. Устойчивость к генетицину (neor) формируется после переноса генов устойчивости к неомицину (neo) из транспозона Tn5 или Tn601 и позволяет клеткам расти в среде, содержащей G418.

Стратегию селекции можно применять для различных типов клеток. Генетицин токсичен для бактерий, дрожжей, простейших, гельминтов и клеток млекопитающих; его также используют для удаления фибробластов, контаминирующих смешанные культуры.

Методика подбора концентрации

Эффективная концентрация зависит от типа клеток, используемой среды, условий роста, скорости метаболизма клеток и фазы клеточного цикла. Концентрацию антибиотика для уничтожения клеток исходной линии рекомендуется определять экспериментально, обрабатывая клетки серией концентраций от 100 мкг/мл до 1 мг/мл.

В целом эффективные концентрации генетицина могут составлять от 100 мкг/мл до 5 мг/мл и выше. Перед применением нового лота генетицина или при использовании препарата в новой системе культивирования рекомендуется построить полную кривую зависимости дозы от эффекта. Слишком низкая концентрация антибиотика или слишком высокая плотность посева могут привести к выживанию клеток, не прошедших селекцию.

При оптимально подобранных условиях контрольные клетки обычно погибают в течение одной недели после добавления антибиотика, а клоны устойчивых клеток формируются через 10–14 дней. Время образования колоний зависит от клеточной линии и эффективности трансфекции.

Рекомендуемые рабочие концентрации

Значения приведены для отдельных клеточных линий; рабочую концентрацию необходимо определять экспериментально.

Протокол селекции стабильных трансфектантов

Клетки трансфицируют плазмидой, содержащей ген neo, и инкубируют в обычной ростовой среде с генетицином для отбора стабильных трансфектантов.

1. Трансфицируйте клетки плазмидой, содержащей ген neo.
2. Через 48 ч после трансфекции перенесите клетки в среду с генетицином в подходящей концентрации.
3. Заменяйте среду с антибиотиком каждые 3–4 дня.
4. Через 7 дней селекции оцените образование очагов роста. В зависимости от клеточной линии и эффективности трансфекции для их формирования может потребоваться ещё неделя или больше.
5. Перенесите и объедините 5–10 устойчивых клонов в чашку для культивирования клеток