G418 disulfate salt HiMedia TC025-1G (1 г)

Антибиотический реагент G418 disulfate salt HiMedia TC025-1G (1 г) — аминогликозидный антибиотик для селекции эукариотических клеток с геном устойчивости neo. Применяется для получения стабильных трансфектантов и поддержания устойчивого фенотипа; рабочую концентрацию необходимо определять экспериментально для каждой клеточной линии и условий культивирования.

Назначение и принцип действия

Генетицин (G418) — аминогликозидный антибиотик, структурно сходный с гентамицином и продуцируемый бактерией Micromonospora rhodorangea. Препарат применяют для селекции эукариотических клеток, стабильно трансфицированных генами устойчивости к неомицину (neo), а также для поддержания фенотипа устойчивости neor. G418 токсичен для бактерий, дрожжей, простейших, гельминтов и клеток млекопитающих; его также используют для удаления загрязняющих культуру фибробластов из смешанных культур.

Генетицин блокирует синтез полипептидов, необратимо связываясь с 80S-рибосомами и ингибируя элонгацию белка в прокариотических и эукариотических клетках. Активность препарата могут инактивировать бактериальные аминогликозидфосфотрансферазы APH(3')II и APH(3')I, кодируемые генами транспозонов Tn5 и Tn601 (903) соответственно. После переноса генов устойчивости к неомицину (neo) из транспозонов Tn5 или Tn601 клетки приобретают устойчивость к генетицину (neor) и могут расти на среде, содержащей G418. Стратегия селекции применима к большинству типов клеток.

Идентификационные данные

Методика подбора концентрации

Эффективная концентрация генетицина зависит от типа клеток, используемой культуральной среды, условий роста, метаболической активности клеток и фазы клеточного цикла. Концентрацию антибиотика в культуральной среде необходимо определять экспериментально. Рекомендуется строить полную дозовую кривую при использовании новой серии генетицина или в новой системе культивирования клеток.

Для определения концентрации, необходимой для гибели исходной клеточной линии, рекомендуется обработать клетки несколькими концентрациями в диапазоне 100 мкг/мл–1 мг/мл. В исследованиях описаны эффективные концентрации от 100 мкг/мл до 5 мг/мл и выше. При слишком низкой концентрации антибиотика или слишком высокой плотности посева клетки могут избежать селекции. В идеале контрольные клетки погибают в течение одной недели после добавления антибиотика, а колонии устойчивых клеток образуются через 10–14 дней.

Рекомендуемые рабочие концентрации для некоторых клеточных линий:

Протокол селекции стабильных трансфектантов

1. Трансфицируйте клетки плазмидой, содержащей ген neo.
2. Через 48 ч после трансфекции перенесите клетки в среду с генетицином в подходящей концентрации.
3. Заменяйте среду с антибиотиком каждые 3–4 дня.
4. Через 7 дней селекции оцените образование фокусов. В зависимости от клеточной линии-хозяина и эффективности трансфекции для образования фокусов может потребоваться ещё неделя или больше.
5. Перенесите и объедините 5–10 устойчивых клонов в чашку для культуры клеток диаметром 35 мм и поддерживайте их ещё 7 дней на селективной среде.

Контроль качества