Silver окрашивание набор HiMedia ML123-1KT (1 набор)

Набор для окрашивания серебром HiMedia ML123-1KT (1 набор) предназначен для выявления белков после электрофореза и обеспечивает чувствительное окрашивание геля. Метод основан на восстановлении ионов серебра; набор предназначен только для лабораторных исследований in vitro.

Идентификация продукта

Принцип окрашивания

Окрашивание серебром основано на восстановлении ионного серебра до металлической формы. Для повышения чувствительности гель перед пропиткой серебром обрабатывают восстанавливающими или сульфидирующими агентами, в том числе глутаровым альдегидом, формальдегидом и тиосульфатом натрия, обладающими сродством к белкам.

Глутаровый альдегид образует с белками основания Шиффа, что приводит к сшиванию аминогрупп и альдегидов; при проявлении это способствует восстановлению серебра. Белковые полосы визуализируются благодаря различию окислительно-восстановительного потенциала участков геля, занятых белком, и соседних участков без белка. Катионы серебра связываются с аминогруппами белков, особенно с аминогруппой лизина, а также с серосодержащими остатками цистеина и метионина.

Гель пропитывают нитратом серебра в слабокислом растворе с pH 6. Перед проявлением из геля отмывают свободный нитрат серебра, поскольку осаждение оксида серебра приводит к высокому фоновому окрашиванию. Проявление проводят селективным восстановлением ионного серебра формальдегидом в щелочной среде, создаваемой карбонатом натрия. Карбонат натрия буферирует муравьиную кислоту, образующуюся при окислении формальдегида; восстановление ионов серебра продолжается до появления белковых полос в геле.

Набор основан на методе M. Swain и N. W. Ross, разработанном в 1995 году. Окрашивание серебром в целом в несколько раз чувствительнее методов с использованием Кумасси бриллиантового синего R-250.

Состав набора

Дополнительно необходимые материалы

• Этанол.
• Вода для молекулярной биологии, код продукта ML024.
• Уксусная кислота, MB052.

Приготовление растворов

Объёмы указаны для приготовления 100 мл каждого раствора.

Фиксирующий раствор

• Этанол: 40 мл.
• Уксусная кислота: 10 мл.
• Дистиллированная вода: 50 мл.

Фиксирующий/сенсибилизирующий раствор

• Этанол: 40 мл.
• Глутаровый альдегид 1,2 %: 4 мл.
• Формальдегид 0,19 %: 2 мл.
• Дистиллированная вода: 54 мл.

Раствор для промывки этанолом

• Этанол: 40 мл.
• Дистиллированная вода: 60 мл.

Сенсибилизирующий раствор

• Тиосульфат натрия 0,5 %: 4 мл.
• Дистиллированная вода: 96 мл.

Раствор нитрата серебра

• Нитрат серебра 2,5 %: 4 мл.
• Дистиллированная вода: 96 мл.

Проявляющий раствор

• Карбонат натрия: 2,5 г.
• Формальдегид 0,19 %: 8 мл.
• Дистиллированная вода: 92 мл.

Стоп-раствор

• Уксусная кислота: 5 мл.
• Дистиллированная вода: 95 мл.

Методика окрашивания

1. После завершения электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) осторожно извлеките гель из пространства между стеклянными пластинами и поместите в чистый лоток. Добавьте 50 мл фиксирующего раствора и выдерживайте 10 мин при постоянном умеренном встряхивании.
2. Слейте фиксирующий раствор. Промывайте гель дистиллированной водой 10 мин.
3. Добавьте 50 мл фиксирующего/сенсибилизирующего раствора и встряхивайте 5 мин.
4. Слейте фиксирующий/сенсибилизирующий раствор. Промывайте гель 40%-м этанолом 20 мин.
5. Промывайте гель дистиллированной водой 20 мин.
6. Добавьте сенсибилизирующий раствор и встряхивайте 1 мин.
7. Слейте сенсибилизирующий раствор и дважды промойте гель дистиллированной водой по 1 мин.
8. Погрузите гель в 50 мл раствора нитрата серебра на 20 мин, убедившись, что гель полностью покрыт жидкостью. Выдерживайте при постоянном умеренном встряхивании.
9. Извлеките гель из окрашивающего раствора и промойте дистиллированной водой 1 мин.
10. Добавьте проявляющий раствор и встряхивайте 1 мин. Удалите раствор и добавьте свежую порцию. Выдерживайте гель в проявляющем растворе до появления отчётливо различимых окрашенных полос разделённых белков.
11. Извлеките гель из проявляющего раствора и погрузите в стоп-раствор на 5 мин, чтобы получить чёткие отдельные полосы.
12. Слейте стоп-раствор и дважды промойте гель дистиллированной водой по 5 мин.

Устранение неполадок

Эффективность и хранение

Ожидаемая эффективность набора обеспечивается при хранении при рекомендованной температуре и использовании до истечения срока годности.

Ограничения применения и безопасность

Набор предназначен для лабораторного применения в исследованиях in vitro. Не используйте его для диагностики человека, в лекарственных целях или для введения человеку, если такое применение прямо не разрешено соответствующими регулирующими органами страны использования.

Набор предназначен только для лабораторного применения; не используйте его в лекарственных, бытовых или иных целях. Перед работой ознакомьтесь с паспортами безопасности реагентов и соблюдайте указанные в них меры предосторожности. При работе с клиническими образцами соблюдайте надлежащую лабораторную практику и установленные правила безопасности. При обращении с описанными материалами соблюдайте осторожность.