Диагностическая казеиновая среда для теста на фолиевую кислоту HiMedia M543. Применяется для микробиологического определения концентрации фолиевой кислоты в сыворотке крови с использованием тест-микроорганизма Lactobacillus casei ATCC 7469.

Принцип измерения

Среда M543 представляет собой химически определенный состав, содержащий все необходимые питательные вещества для роста Lactobacillus rhamnosus casei, за исключением фолиевой кислоты. Рост тест-микроорганизма прямо пропорционален концентрации добавленной фолиевой кислоты, что позволяет определить её содержание в исследуемом образце по интенсивности роста (турбидиметрии). Формулировка основана на методах Флинна и др., с модификациями Бейкера и др., а также Уотерса и Моллина.

Методика проведения анализа

Подготовка стандартного раствора фолиевой кислоты

1. Растворите 20 мг сухой фолиевой кислоты в 100 мл дистиллированной воды, содержащей 20 мл этанола.
2. Доведите pH раствора до 10,0 с помощью 0,1 N NaOH для полного растворения кислоты, затем скорректируйте pH до 7,0 с помощью 0,05 N HCl. Полученный раствор содержит 200 мкг/мл фолиевой кислоты.
3. Разведите 1 мл этого раствора в 999 мл дистиллированной воды (получено 200 нг/мл).
4. Разведите 1 мл полученного раствора в 999 мл буфера для фолиевой кислоты A (M544) для получения стандартного раствора с концентрацией 0,2 нг/мл.
5. Для построения калибровочной кривой используйте объемы 0,0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 мл на пробирку.

Подготовка образцов сыворотки

1. Консервация: После отделения сыворотки от крови перенесите её в чистую сухую пробирку, центрифугируйте для удаления остаточных клеток крови (избегайте гемолиза эритроцитов). В каждую пробирку с 5 мл сыворотки добавьте 25 мг аскорбиновой кислоты. Храните при температуре ниже −20 °C.
2. Подготовка к анализу: Разморозьте сыворотку с аскорбиновой кислотой. Смешайте 5 мл образца с 45 мл регидратированного буфера для фолиевой кислоты A (M544).
3. Инкубируйте смесь при 37 °C в течение 90 минут, затем стерилизуйте в автоклаве при температуре 121 °C (давление $\approx$0,07 МПа / 15 psi) в течение 2,5 минут.
4. Удалите коагулированный белок центрифугированием; супернатант перенесите в чистую сухую пробирку.

Процедура определения общей концентрации фолиевой кислоты

1. Внесите в пробирки подготовленные экстракты сыворотки (объемом 0,5; 1,0; 1,5 мл или иные объемы).
2. Добавьте в каждую пробирку 5 мл среды M543 и дистиллированную воду до достижения общего объема 10 мл.
3. Стерилизуйте пробирки в автоклаве при 121 °C (давление $\approx$0,07 МПа / 15 psi) в течение 5 минут.
4. После охлаждения внесите в каждую пробирку одну каплю инокулята.
5. Инкубируйте при 35–37 °C в течение 18–24 часов.
6. Перед считыванием результатов выдержите пробирки в холодильнике 15–30 минут для остановки роста.
7. Измерьте оптическую плотность (турбидиметрия) при длине волны 620 нм.
8. Рассчитайте содержание фолиевой кислоты в образцах, используя данные стандартной кривой с учетом разведения.

Подготовка инокулята

1. Сток-культуры Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 готовят путем инокуляции в агар для лактобацилл AOAC (M366). После инкубации при 35–37 °C в течение 18–24 часов пробирки хранят в холодильнике с ежемесячным перепосевом.
2. Рабочий инокулят готовят путем пересева сток-культуры в 10 мл бульона для инокуляции микровитаминных тестов (M133) или бульона для лактобацилл (M367).
3. После 24 часов инкубации при 35–37 °C клетки центрифугируют в асептических условиях, супернатант декантируют.
4. Клетки ресуспендируют в 10 мл стерильной среды M543 (одинарной концентрации), повторно центрифугируют и промывают.
5. Окончательно ресуспендируют клетки в 10 мл стерильной среды M543 и разводят 1:100 этой же средой. Для инокуляции каждой пробирки используется одна капля данной суспензии. (В качестве альтернативы для промывки и разведения можно использовать 0,85 % раствор NaCl).

Приготовление среды

1. Растворите 9,4 г порошка в 100 мл очищенной или дистиллированной воды, содержащей 50 мг аскорбиновой кислоты.
2. Нагрейте до кипения для полного растворения компонентов.
3. Для проведения анализа разлейте по 5 мл среды в каждую пробирку. После добавления стандартного или тестового раствора доведите общий объем до 10 мл дистиллированной водой.
4. Стерилизуйте в автоклаве при 121 °C (давление $\approx$0,07 МПа / 15 psi) в течение 5 минут.

Технические характеристики

Состав (г/л)

Эквивалентно кислотному гидролизату казеина без витаминов.

Физико-химические свойства и контроль качества

• Внешний вид: однородный свободно текущий порошок от почти белого до желтого цвета.
• Цвет и прозрачность готовой среды: светло-янтарный прозрачный раствор (допускается незначительный осадок).
• Значение pH (при 25 °C): 6,7 ± 0,1 (диапазон 6,60–6,80).
• Культуральная реакция: при использовании Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 после инкубации при 35–37 °C в течение 16–18 часов наблюдается хороший рост. Зафиксировано постепенное увеличение роста при повышении концентрации стандартной фолиевой кислоты (0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1 нг на пробирку), что соответствует увеличению абсорбции при 620 нм.

Дополнительные параметры

Условия эксплуатации и хранения

• Хранение: при температуре 2–8 °C в плотно закрытом контейнере.
• Особенности: продукт гигроскопичен; после вскрытия бутыль следует плотно закрывать для предотвращения комкования. Хранить в сухом вентилируемом помещении, вдали от источников возгорания и экстремальных температур.
• Срок годности: использовать до даты, указанной на этикетке. Рекомендуется использовать свежеприготовленную среду.

Меры предосторожности и ограничения

• Назначение: только для диагностики in vitro и профессионального использования.
• Безопасность: использовать защитные перчатки, одежду, средства защиты глаз и лица. Соблюдать правила микробиологической безопасности при работе с клиническими образцами.
• Утилизация: загрязненные материалы и остатки среды должны быть стерилизованы в автоклаве или подвергнуты инсинерации перед утилизацией.
• Ограничения: для подтверждения результатов рекомендуется проведение дополнительных биохимических тестов.
• Требования к посуде: использовать только чистую стеклянную посуду, очищенную от моющих средств; даже минимальное загрязнение посторонними веществами может привести к ошибочным результатам.