Питательная среда HiMedia M543-100G Среда Casei для фолиевой кислоты — порошковая среда для микробиологического определения фолиевой кислоты в сыворотке крови с использованием Lactobacillus casei ATCC 7469. Применяется в профессиональных микробиологических и клинико-диагностических лабораториях; хранится при температуре 2–8 °C и предназначена только для профессионального применения in vitro.

Назначение

Среда рекомендована для микробиологического определения фолиевой кислоты в сыворотке крови с использованием Lactobacillus casei ATCC 7469 в качестве тест-организма.

Тип образца: клинические образцы — сыворотка крови.

Состав

Состав на 1 л:

Формула скорректирована и стандартизирована для соответствия параметрам рабочих характеристик.

Эквивалентно гидролизату казеина без витаминов.

Конечный pH при 25 °C: 6,7 ± 0,1.

Принцип измерения

Нормальный уровень фолиевой кислоты в сыворотке крови у здоровых людей указан как 9,9 мг/мл. При патологических состояниях и заболеваниях этот уровень значительно изменяется.

Среда Casei для фолиевой кислоты содержит все необходимые для роста тест-организма питательные вещества, за исключением фолиевой кислоты. Добавление фолиевой кислоты в последовательно возрастающих концентрациях вызывает соответствующее увеличение роста Lactobacillus.

В описании методики тест-организм указан как Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469; в разделе назначения указан Lactobacillus casei ATCC 7469. Среда основана на рецептуре Flynn и соавторов, модифицированной Baker и соавторами, а также Waters и Mollin.

Для витаминного микробиологического анализа обычно используют три среды:

• среду для поддержания культуры;
• среду для приготовления инокулята;
• тестовую среду.

Тестовая среда обычно представляет собой химически определённую среду, содержащую все ингредиенты и питательные вещества, необходимые для роста тест-организма, кроме исследуемого вещества. В среде Casei для фолиевой кислоты таким исследуемым веществом является фолиевая кислота.

Приготовление среды

1. Суспендируйте 9,4 г порошка в 100 мл очищенной или дистиллированной воды, содержащей 50 мг аскорбиновой кислоты.
2. Нагрейте до кипения для полного растворения среды.
3. Для анализа внесите по 5 мл приготовленной среды в каждую пробирку.
4. После добавления стандартного раствора и исследуемого раствора доведите объём в пробирке до 10 мл дистиллированной водой.
5. Стерилизуйте автоклавированием при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм и температуре 121 °C в течение 5 мин.

Стандартную кривую получают с использованием фолиевой кислоты в концентрациях 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1 нг на аналитическую пробирку объёмом 10 мл.

Подготовка и поддержание культуры

1. Исходные культуры Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 готовят методом укола в агар для лактобацилл AOAC (M366).
2. После инкубации при 35–37 °C в течение 18–24 ч пробирки хранят в холодильнике.
3. Пересев выполняют с интервалом 1 месяц.
4. Инокулят для анализа готовят субкультивированием Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 в пробирку, содержащую 10 мл бульона для инокулята витаминного микробиологического теста (M133) или бульона для лактобацилл (M367).
5. После инкубации при 35–37 °C в течение 24 ч клетки асептически центрифугируют, затем надосадочную жидкость декантируют.
6. Клетки ресуспендируют в 10 мл стерильной среды Casei для фолиевой кислоты одинарной концентрации.
7. Клетки повторно осаждают центрифугированием, как описано выше, и ещё один раз промывают.
8. Отмытые клетки ресуспендируют в 10 мл стерильной среды Casei для фолиевой кислоты одинарной концентрации (M543).
9. Полученную суспензию разводят в соотношении 1:100 той же средой.
10. По одной капле приготовленной суспензии используют для инокуляции каждой аналитической пробирки.

Для промывания и разведения инокулята вместо базовой среды одинарной концентрации можно использовать 0,85%-ный раствор NaCl.

Стандартную кривую необходимо строить для каждого анализа, поскольку условия стерилизации, температура инкубации и другие факторы, влияющие на показания стандартной кривой, невозможно полностью воспроизвести от анализа к анализу.

Стандартную кривую получают с использованием фолиевой кислоты в концентрациях 0,0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1 нг на аналитическую пробирку объёмом 10 мл.

Приготовление концентраций фолиевой кислоты

1. Растворите 20 мг сухой фолиевой кислоты в 100 мл дистиллированной воды, содержащей 20 мл этанола.
2. Для растворения кислоты доведите pH раствора до 10,0 раствором NaOH концентрацией 0,1 N.
3. Затем доведите pH до 7,0 раствором HCl концентрацией 0,05 N.
4. Полученный раствор содержит 200 мкг фолиевой кислоты в 1 мл.
5. Разведите 1 мл этого раствора в 999 мл дистиллированной воды, чтобы получить раствор с концентрацией 200 нг/мл.
6. Разведите 1 мл полученного раствора в 999 мл буфера A для фолиевой кислоты (M544), чтобы получить стандартный раствор с концентрацией 0,2 нг фолиевой кислоты в 1 мл.
7. Используйте по 0,0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 мл стандартного раствора на аналитическую пробирку.

Сохранение образца сыворотки

1. Дайте образцу крови свернуться для отделения сыворотки.
2. Отделите сыворотку в чистую сухую пробирку.
3. Центрифугируйте сыворотку для удаления присутствующих клеток крови.
4. Не допускайте гемолиза эритроцитов.
5. Разлейте по 5 мл образца сыворотки в чистые сухие пробирки.
6. Добавьте в каждую пробирку по 25 мг аскорбиновой кислоты.
7. Храните пробирки в замороженном состоянии при температуре ниже −20 °C до проведения анализа.

Подготовка образцов сыворотки

1. Разморозьте сыворотку, содержащую аскорбиновую кислоту.
2. Добавьте 5 мл этого образца к 45 мл восстановленного буфера A для фолиевой кислоты (M544).
3. Инкубируйте полученный раствор сыворотки с буфером при 37 °C в течение 90 мин.
4. Затем автоклавируйте раствор при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм и температуре 121 °C в течение 2,5 мин.
5. Удалите коагулированный белок центрифугированием.
6. Перенесите надосадочную жидкость в чистую сухую пробирку.
7. Полученный прозрачный раствор используйте как образец для анализа фолиевой кислоты.

Определение общей концентрации фолиевой кислоты

1. Используйте 0,5; 1,0; 1,5 мл или другие объёмы приготовленных экстрактов сыворотки, как описано выше.
2. Добавьте в каждую пробирку 5 мл среды Casei для фолиевой кислоты и достаточное количество дистиллированной воды для получения общего объёма 10 мл на пробирку.
3. Стерилизуйте пробирки при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм и температуре 121 °C в течение 5 мин.
4. Охладите пробирки.
5. Добавьте по одной капле инокулята в каждую аналитическую пробирку.
6. Инкубируйте пробирки при 35–37 °C в течение 18–24 ч.
7. Для остановки роста поместите пробирки в холодильник на 15–30 мин перед измерением.
8. Выполните турбидиметрическое