HiMedia M2014-100G Модифицированная среда Casei для фолиевой кислоты

Питательная микробиологическая среда HiMedia M2014-100G Модифицированная среда Casei для фолиевой кислоты предназначена для микробиологического анализа фолиевой кислоты в сыворотке крови с использованием Lactobacillus casei ATCC 7469. Среда содержит все необходимые питательные компоненты, кроме фолиевой кислоты, а результат анализа оценивают по приросту мутности при 620 нм.

Назначение

Среда HiMedia M2014-100G предназначена для микробиологического определения фолиевой кислоты в сыворотке крови с использованием тест-организма Lactobacillus casei ATCC 7469.

Препарат предназначен для диагностики in vitro и профессионального применения. Тип образца: клинические образцы — сыворотка крови.

Среда сформулирована по Flynn et al., 1951, Analytical Chemistry, 23:180, с модификациями Baker et al. и Waters and Mollin.

Принцип анализа

Нормальный уровень фолиевой кислоты в сыворотке крови у человека составляет 9,9 нг/мл. При патологических состояниях и заболеваниях организма этот уровень существенно изменяется.

Модифицированная среда Casei для фолиевой кислоты содержит все необходимые для роста Lactobacillus casei питательные вещества, за исключением фолиевой кислоты. Добавление фолиевой кислоты в заданных возрастающих концентрациях вызывает соответствующее увеличение роста L. casei. Рост оценивают по увеличению мутности и эквивалентному повышению оптической плотности при 620 нм.

Для витаминологического анализа тест-организму обычно требуются три среды:

• среда для поддержания культуры;
• инокуляционная среда;
• тестовая среда.

Тестовая среда обычно представляет собой химически определённую среду, содержащую все ингредиенты и питательные вещества, необходимые для роста тест-организма, за исключением исследуемого вещества.

Примечание: L. casei в настоящее время известен как L. rhamnosus.

Состав

Формула скорректирована и стандартизирована в соответствии с параметрами эффективности.

Технические характеристики

• Производитель: HiMedia
• Артикул: M2014-100G
• Назначение изделия: питательная среда
• Физическая форма: порошок
• Тип продукта: стандартный
• Упаковка: стеклянный флакон
• Вес: 100 г
• Происхождение: животное
• Конечный pH при 25 °C: 6,7 ± 0,1
• pH: 6,60–6,80
• Температура хранения: 2–8 °C

Приготовление среды

1. Суспендируйте 9,372 г порошка в 100 мл очищенной или дистиллированной воды, содержащей 50 мг аскорбиновой кислоты.
2. Кипятите суспензию в течение 1–2 мин.
3. Разлейте среду по 5 мл в пробирки.
4. После добавления стандартного раствора и исследуемого раствора доведите объём в каждой пробирке дистиллированной водой до 10 мл.
5. Стерилизуйте среду в автоклаве при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм, что соответствует примерно 0,10 МПа, при 121 °C в течение 5 мин.

Стандартную кривую получают с использованием фолиевой кислоты в концентрациях 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1 нг на аналитическую пробирку объёмом 10 мл.

Подготовка тест-культуры и инокулята

1. Приготовьте маточные культуры Lactobacillus casei ATCC 7469 методом укола в агар Lactobacilli Agar AOAC (M366).
2. Инкубируйте пробирки при 35–37 °C в течение 18–24 ч.
3. После инкубации храните пробирки в холодильнике.
4. Пересев маточной культуры выполняйте ежемесячно.
5. Для приготовления инокулята проведите субкультивирование Lactobacillus casei ATCC 7469 из маточной культуры в пробирку, содержащую 10 мл бульона для инокуляции Micro Vitamin Test Inoculum Broth (M133) или бульона Lactobacilli Broth (M367).
6. Инкубируйте культуру при 35–37 °C в течение 24 ч.
7. В асептических условиях центрифугируйте клетки и декантируйте супернатант.
8. Ресуспендируйте клетки в 10 мл стерильной модифицированной среды Casei для фолиевой кислоты однократной концентрации.
9. Повторно осадите клетки центрифугированием в тех же условиях и промойте их ещё один раз.
10. Ресуспендируйте промытые клетки в 10 мл стерильной модифицированной среды Casei для фолиевой кислоты однократной концентрации (M2014).
11. Разведите полученную суспензию в соотношении 1:100 той же средой.
12. Используйте по одной капле приготовленной суспензии для инокуляции каждой аналитической пробирки.

Для промывки и разведения инокулята вместо базовой среды однократной концентрации можно использовать 0,85%-ный раствор NaCl.

Стандартная кривая

Стандартную кривую необходимо строить для каждого анализа отдельно, поскольку условия стерилизации, температура инкубации и другие факторы, влияющие на показания стандартной кривой, невозможно полностью воспроизвести от анализа к анализу.

Стандартную кривую получают с использованием фолиевой кислоты в количествах 0,0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1 нг на аналитическую пробирку объёмом 10 мл.

Приготовление растворов фолиевой кислоты

1. Растворите 20 мг сухой фолиевой кислоты в 100 мл дистиллированной воды, содержащей 20 мл этанола.
2. Для растворения кислоты отрегулируйте pH раствора до 10,0 с помощью 0,1-нормального раствора NaOH.
3. Затем доведите pH до 7,0 с помощью 0,05-нормального раствора HCl.
4. Полученный раствор содержит 200 мкг фолиевой кислоты в 1 мл.
5. Разведите 1 мл этого раствора в 999 мл дистиллированной воды, чтобы получить раствор с концентрацией 200 нг/мл.
6. Разведите 1 мл полученного раствора в 999 мл буферного раствора для фолиевой кислоты A (M544), чтобы получить стандартный раствор с концентрацией 0,2 нг фолиевой кислоты в 1 мл.
7. Используйте по 0,0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 мл стандартного раствора на аналитическую пробирку.

Хранение сыворотки

1. Дайте образцу крови свернуться для отделения сыворотки.
2. Перенесите сыворотку в чистую сухую пробирку.
3. Центрифугируйте образец для удаления оставшихся клеток крови.
4. Не допускайте гемолиза эритроцитов.
5. Разлейте по 5 мл образца сыворотки в чистые сухие пробирки.
6. Добавьте в каждую пробирку по 25 мг аскорбиновой кислоты.
7. Храните пробирки в замороженном состоянии при температуре ниже −20 °C до проведения анализа.

Подготовка образцов сыворотки

1. Разморозьте сыворотку, содержащую аскорбиновую кислоту.
2. Добавьте 5 мл образца к 45 мл восстановленного буферного раствора для фолиевой кислоты A (M544).
3. Инкубируйте смесь сыворотки и буферного раствора при 37 °C в течение 90 мин.
4. Автоклавируйте смесь при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм, что соответствует примерно 0,10 МПа, при 121 °C в течение 2,5 мин.
5. Удалите коагулированный белок центрифугированием.
6. Перенесите супернатант в чистую сухую пробирку.
7. Используйте полученный прозрачный раствор в качестве образца для анализа фолиевой кислоты.

Методика определения общей концентрации фолиевой кислоты

1. Используйте 0,5; 1,0; 1,5 мл или другие объёмы подготовленного экстракта сыворотки, как описано выше.
2. Добавьте в каждую пробирку по 5 мл модифицированной среды Casei для фолиевой кислоты.
3. Добавьте достаточное количество дистиллированной воды, чтобы общий