HiMedia M2014-100G Модифицированная среда Casei для фолиевой кислоты

Модифицированная среда Casei для фолиевой кислоты HiMedia M2014-100G предназначена для микробиологического анализа содержания фолиевой кислоты в сыворотке крови с использованием тест-организма Lactobacillus casei ATCC 7469. Среда представляет собой химически определенный состав, содержащий все необходимые питательные вещества для роста L. casei, за исключением фолиевой кислоты.

Принцип измерения

Метод основан на зависимости роста тест-организма Lactobacillus casei (в современной номенклатуре L. rhamnosus) от концентрации фолиевой кислоты. Поскольку среда M2014 лишена этого витамина, добавление фолиевой кислоты в возрастающих концентрациях вызывает пропорциональное увеличение интенсивности роста бактерий, что фиксируется турбидиметрически.

Состав

Состав, г/л:

Значение pH при 25 °C: 6,7 ± 0,1.

Методика проведения анализа

Приготовление среды

1. Суспендируйте 9,372 г порошка в 100 мл очищенной или дистиллированной воды, содержащей 50 мг аскорбиновой кислоты.
2. Прокипятите раствор в течение 1–2 минут.
3. Разлейте по 5 мл в пробирки.
4. После добавления стандартного и исследуемого растворов доведите общий объем в пробирке до 10 мл дистиллированной водой.
5. Стерилизуйте в автоклаве при температуре 121 °C (давление ≈0,1 МПа) в течение 5 минут.

Подготовка инокулята

1. Стоковые культуры Lactobacillus casei ATCC 7469 готовят путем укольного посева на агар для лактобацилл AOAC (M366). После инкубации при 35–37 °C в течение 18–24 ч пробирки хранят в холодильнике, перенося культуру ежемесячно.
2. Для анализа субкультивируют штамм из стока в 10 мл бульона для инокуляции микровитаминов (M133) или бульона для лактобацилл (M367).
3. После 24 ч инкубации при 35–37 °C клетки центрифугируют в асептических условиях, супернатант сливают.
4. Клетки ресуспендируют в 10 мл стерильной среды Folic Acid Casei Medium (Modified), повторно центрифугируют и промывают еще раз.
5. Очищенные клетки ресуспендируют в 10 мл стерильной среды M2014 и разводят 1:100 этой же средой.
6. Для инокуляции каждой пробирки используют одну каплю данной суспензии. В качестве альтернативы для промывки и разведения инокулята можно использовать 0,85 % раствор NaCl.

Подготовка стандартного раствора

1. Растворите 20 мг сухой фолиевой кислоты в 100 мл дистиллированной воды, содержащей 20 мл этанола.
2. Доведите pH до 10,0 с помощью 0,1 N NaOH для растворения кислоты, затем скорректируйте pH до 7,0 с помощью 0,05 N HCl. Получен раствор с концентрацией 200 мкг/мл.
3. Разведите 1 мл этого раствора в 999 мл дистиллированной воды (получится 200 нг/мл).
4. Разведите 1 мл полученного раствора в 999 мл буфера для фолиевой кислоты A (M544) для получения стандартного раствора с концентрацией 0,2 нг/мл.
5. Для построения калибровочной кривой используйте объемы 0,0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 мл на пробирку.

Подготовка образцов сыворотки

1. Консервация: После отделения сыворотки от сгустка крови перенесите её в чистую сухую пробирку, центрифугируйте для удаления клеток крови (избегайте гемолиза эритроцитов). Разлейте по 5 мл в пробирки, добавьте в каждую 25 мг аскорбиновой кислоты. Храните в замороженном состоянии при температуре ниже −20 °C.
2. Подготовка к анализу: Разморозьте сыворотку с аскорбиновой кислотой. Добавьте 5 мл образца к 45 мл регидратированного буфера для фолиевой кислоты A (M544). Инкубируйте смесь при 37 °C в течение 90 минут, затем автоклавируйте при 121 °C (давление ≈0,1 МПа) в течение 2,5 минут. Удалите коагулированный белок центрифугированием; супернатант перенесите в чистую сухую пробирку.

Процедура определения общей концентрации фолиевой кислоты

1. Внесите в пробирки подготовленные экстракты сыворотки (объемом 0,5; 1,0; 1,5 мл или иные объемы).
2. Добавьте 5 мл среды Folic Acid Casei Medium, Modified и дистиллированную воду до достижения общего объема 10 мл.
3. Стерилизуйте пробирки при 121 °C (давление ≈0,1 МПа) в течение 5 минут.
4. После охлаждения добавьте в каждую пробирку одну каплю инокулята.
5. Инкубируйте при 35–37 °C в течение 18–24 часов.
6. Перед считыванием поместите пробирки в холодильник на 15–30 минут для остановки роста.
7. Измерьте мутность (турбидиметрия) при длине волны 620 нм.
8. Рассчитайте количество фолиевой кислоты в образцах, используя данные стандартной кривой с учетом разведения.

Технические характеристики

• Вес: 100 г
• Внешний вид: однородный свободнотекущий порошок от почти белого до желтого цвета
• Цвет и прозрачность готовой среды: светло-янтарный прозрачный раствор (допускается небольшой осадок)
• Диапазон pH (9,372 % раствор при 25 °C): 6,60–6,80
• Происхождение компонентов: животное
• Тип продукта: стандартная среда
• Форма выпуска: порошок
• Тип упаковки: стеклянная бутылка

Область применения

Среда используется для количественного определения содержания фолиевой кислоты в сыворотке крови. Применяется в клинических и исследовательских лабораториях для диагностики состояний, связанных с изменением уровня фолатов в организме.

Условия эксплуатации и хранения

• Температура хранения: 2–8 °C в плотно закрытом контейнере.
• Особенности: продукт гигроскопичен; после вскрытия бутылку следует плотно закрыть во избежание комкования.
• Хранить в сухом проветриваемом помещении, вдали от источников возгорания и экстремальных температур.
• Рекомендуется использовать свежеприготовленную среду в пределах срока годности.

Меры предосторожности и ограничения

• Только для диагностики in vitro. Только для профессионального использования.
• При работе с клиническими образцами соблюдайте стандартные правила микробиологической безопасности.
• Используйте чистую стеклянную посуду, не содержащую остатков моющих средств; даже минимальное загрязнение может привести к ошибочным результатам.
• Для подтверждения результатов рекомендуется проведение дополнительных биохимических тестов.
• Контаминированные материалы перед утилизацией подлежат обязательному автоклавированию или сжиганию.