Питательная микробиологическая среда HiMedia M126-500G Среда для фолиевой кислоты, AOAC в форме порошка массой 500 г с конечным pH 6,7 ± 0,2. Среда предназначена для микробиологического анализа фолиевой кислоты с использованием Enterococcus hirae ATCC 8043; для каждого анализа требуется построение отдельной стандартной кривой.

Назначение

Среда рекомендована для микробиологического анализа фолиевой кислоты с использованием тест-организма Enterococcus hirae ATCC 8043. Тип образца: чистые изоляты.

Среда содержит необходимые питательные компоненты, за исключением фолиевой кислоты: аминокислоты, углеводы, пурины, пиримидины, соли и витамины. Фолиевая кислота необходима для роста Enterococcus hirae, поэтому рост тест-организма происходит только при наличии фолиевой кислоты в анализируемой пробе.

Концентрацию фолиевой кислоты в образце определяют сравнением полученного роста с ростом, соответствующим известным концентрациям фолиевой кислоты, по стандартной кривой.

Формула среды подготовлена по составу, описанному Capps и соавторами, и рекомендована AOAC для определения содержания фолиевой кислоты в фармацевтических препаратах и других материалах с использованием Enterococcus hirae ATCC 8043. Стандартный источник методики анализа фолиевой кислоты следует использовать в соответствии с применяемой процедурой AOAC.

Принцип измерения

Рост Enterococcus hirae зависит от содержания фолиевой кислоты в анализируемом образце. При увеличении концентрации фолиевой кислоты увеличивается рост тест-организма, что регистрируется:

• турбидиметрически — по увеличению оптической плотности при 620 нм;
• ацидиметрически — по результату после более длительной инкубации.

Для количественного определения используют ряд стандартов фолиевой кислоты с концентрациями 0, 2, 4, 6, 8 и 10 нг на пробирку с 10 мл среды.

Состав

Состав на 1 л:

Формула скорректирована и стандартизирована для обеспечения заданных рабочих параметров.

Ациказа без витаминов эквивалентна кислотному гидролизату казеина, не содержащему витаминов.

Конечный pH при 25 °C: 6,7 ± 0,2.

Приготовление среды

1. Суспендируйте 11,1 г порошка в 100 мл очищенной или дистиллированной воды.
2. Нагревайте до кипения в течение 2–3 мин.
3. Перемешайте для равномерного распределения небольшого осадка.
4. Для анализа внесите по 5 мл среды в каждую аналитическую пробирку, содержащую возрастающие количества стандарта или неизвестной пробы.
5. Доведите общий объём в каждой пробирке до 10 мл дистиллированной водой.
6. Стерилизуйте в автоклаве при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм (≈0,103 МПа) и температуре 121 °C в течение 5 мин.
7. Охладите среду до 45–50 °C.

Удовлетворительные результаты получают при содержании фолиевой кислоты 0, 2, 4, 6, 8 и 10 нг на аналитическую пробирку с общим объёмом 10 мл.

Методика проведения анализа

Подготовка тест-культуры и посевного материала

1. Приготовьте маточные культуры Enterococcus hirae ATCC 8043 методом укола в среду «Агар Лактобацилли AOAC» (M366).
2. Инкубируйте пробирки при 35–37 °C в течение 24 ч.
3. После инкубации храните пробирки в холодильнике.
4. Пересев маточных культур выполняйте с интервалом один месяц.
5. Для приготовления посевного материала перенесите культуру из маточной культуры Enterococcus hirae ATCC 8043 в пробирку, содержащую 10 мл среды «Бульон Лактобацилли AOAC» (M367).
6. Инкубируйте при 35–37 °C в течение 24 ч.
7. В асептических условиях центрифугируйте клетки и декантируйте надосадочную жидкость.
8. Ресуспендируйте клетки в 10 мл стерильного 0,85%-ного раствора NaCl.
9. Разведите полученную клеточную суспензию в соотношении 1:100 стерильным 0,85%-ным раствором NaCl.
10. Используйте по одной капле полученной суспензии для инокуляции каждой аналитической пробирки.

Построение стандартной кривой и регистрация результатов

Стандартную кривую необходимо строить для каждого отдельного анализа. Условия автоклавирования, температура инкубации и другие факторы, влияющие на показания стандартной кривой, невозможно полностью воспроизвести от анализа к анализу.

Для построения стандартной кривой используйте фолиевую кислоту в концентрациях 0, 2, 4, 6, 8 и 10 нг на аналитическую пробирку с общим объёмом 10 мл.

Для прекращения роста перед считыванием результата охладите пробирки в холодильнике в течение 15–30 мин.

• Турбидиметрические показания считывайте после инкубации в течение 16–18 ч при 35–37 °C.
• Ацидиметрические показания считывайте после инкубации в течение 72 ч при 35–37 °C.

Для приготовления маточного раствора используйте 20 мг фолиевой кислоты.

Приготовление растворов фолиевой кислоты

1. Растворите 20 мг сухой фолиевой кислоты в 100 мл дистиллированной воды, содержащей 20 мл этанола.
2. Для растворения кислоты доведите pH раствора до 10,0 с помощью 0,1 н. раствора NaOH.
3. Затем доведите pH до 7,0 с помощью 0,05 н. раствора HCl.
4. Полученный раствор содержит 200 мкг фолиевой кислоты в 1 мл.
5. Разведите 1 мл этого раствора в 999