Специализированная питательная среда «Среда для микробиологического испытания фолиевой кислоты HiMedia M126-100G (уп/100 гр)» производства HiMedia выпускается в виде сухого порошка. Среда предназначена для микробиологического количественного определения фолиевой кислоты с использованием Enterococcus hirae ATCC 8043; рабочий диапазон стандартов составляет 0, 2, 4, 6, 8 и 10 нг на пробирку с общим объёмом 10 мл.

Назначение

Среда применяется для микробиологического анализа содержания фолиевой кислоты в лекарственных препаратах и других материалах.

Тест-микроорганизм: Enterococcus hirae ATCC 8043.

Тип образца: чистые изоляты.

Сертификат: ФСЗ 2009/03705.

Методика основана на сравнении роста тест-микроорганизма в исследуемых образцах и средах с известными концентрациями фолиевой кислоты по стандартной кривой.

Состав

Состав на 1 л среды:

Формула скорректирована и стандартизирована для обеспечения заданных рабочих характеристик.

Безвитаминный ациказ является эквивалентом кислотного гидролизата казеина без витаминов.

Принцип измерения

Среда содержит все питательные вещества, необходимые для роста тест-микроорганизма, за исключением фолиевой кислоты. В состав входят аминокислоты, углеводы, пурины, пиримидины, соли и витамины.

Фолиевая кислота необходима для роста Enterococcus hirae, поэтому рост микроорганизма происходит только при наличии фолиевой кислоты в анализируемой пробе. Точную концентрацию фолиевой кислоты определяют сравнением роста, полученного для исследуемого образца, с ростом при известных стандартных концентрациях фолиевой кислоты по стандартной кривой.

Среда приготовлена по формуле Capps et al. и рекомендована AOAC для определения содержания фолиевой кислоты в фармацевтических препаратах и других материалах с использованием Enterococcus hirae ATCC 8043.

Для проведения анализа следует использовать стандартный справочный метод определения фолиевой кислоты.

Приготовление среды

1. Суспендируйте 11,1 г сухой среды в 100 мл очищенной или дистиллированной воды.
2. Нагревайте до кипения в течение 2–3 мин.
3. Перемешайте для равномерного распределения небольшого количества осадка.
4. Для анализа внесите по 5 мл среды в каждую аналитическую пробирку, содержащую возрастающие количества стандартного или исследуемого раствора.
5. Доведите общий объём в каждой пробирке до 10 мл дистиллированной водой.
6. Стерилизуйте автоклавированием при давлении 15 фунтов на кв. дюйм (ориентировочно 0,103 МПа) и температуре 121 °C в течение 5 мин.
7. Охладите среду до 45–50 °C.

Удовлетворительные результаты получают при содержании фолиевой кислоты 0, 2, 4, 6, 8 и 10 нг на аналитическую пробирку объёмом 10 мл.

Методика проведения анализа

1. Приготовьте маточные культуры Enterococcus hirae ATCC 8043 посевом уколом в агар Лактобацилли AOAC (M366).
2. Инкубируйте пробирки при 35–37 °C в течение 24 ч.
3. Храните пробирки в холодильнике.
4. Пересев маточных культур выполняйте с интервалом 1 месяц.
5. Для приготовления инокулята перенесите культуру из маточной культуры Enterococcus hirae ATCC 8043 в пробирку, содержащую 10 мл бульона Лактобацилли AOAC (M367).
6. Инкубируйте при 35–37 °C в течение 24 ч.
7. В асептических условиях центрифугируйте клетки и декантируйте надосадочную жидкость.
8. Ресуспендируйте клетки в 10 мл стерильного 0,85%-ного раствора NaCl.
9. Разведите полученную клеточную суспензию в соотношении 1:100 стерильным 0,85%-ным раствором NaCl.
10. Внесите по одной капле полученной суспензии в каждую аналитическую пробирку.
11. Для каждого отдельного анализа обязательно стройте стандартную кривую, поскольку условия автоклавирования, температура инкубации и другие факторы, влияющие на показания стандартной кривой, невозможно полностью воспроизвести от анализа к анализу.
12. Для построения стандартной кривой используйте фолиевую кислоту в концентрациях 0, 2, 4, 6, 8 и 10 нг на аналитическую пробирку объёмом 10 мл.
13. Для остановки роста охладите пробирки в холодильнике в течение 15–30 мин перед считыванием результатов.
14. При турбидиметрическом методе считывайте показания после инкубации в течение 16–18 ч при 35–37 °C.
15. При ацидиметрическом методе считывайте показания после инкубации в течение 72 ч при 35–37 °C.
16. Для приготовления маточного раствора используйте 20 мг фолиевой кислоты.

Приготовление концентраций фолиевой кислоты

1. Растворите 20 мг сухой фолиевой кислоты в 100 мл дистиллированной воды, содержащей 20 мл этанола.
2. Для растворения кислоты доведите pH раствора до 10,0 с помощью 0,1 N раствора NaOH.
3. Затем доведите pH до 7,0 с помощью 0,05 N раствора HCl.
4. Полученный раствор содержит 200 мкг фолиевой кислоты в 1 мл.
5. Разведите 1 мл этого раствора в 999 мл дистиллированной воды для получения раствора с концентрацией 200 нг/мл.
6. Разведите 1 мл полученного раствора в 999 мл буферного раствора A для фолиевой кислоты (M544) для получения стандартного раствора с концентрацией 0,2 нг фолиевой кислоты в 1 мл.
7. Вносите в каждую аналитическую пробирку 0,0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 или 5,0 мл стандартного раствора.

Подготовка образцов и требования к работе

Необходимо принимать особые меры для предотвращения загрязнения среды или стеклянной посуды, используемой при анализе.

Следует использовать чистую стеклянную посуду, не содержащую следов моющих средств.