HiPer® PCR Mediated Site Directed Mutagenesis учебный набор HiMedia HTBM029-5PR (5 преп.)

HiPer® PCR Mediated Site Directed Mutagenesis учебный набор HiMedia HTBM029-5PR (5 преп.) — учебный набор для направленного мутагенеза с использованием высокоточной ДНК-полимеразы. Набор предназначен для создания целевых генетических изменений в заданных позициях; процедура включает обработку ДНК эндонуклеазой Dpn I и трансформацию компетентных клеток XL1-Blue.

Принцип метода

Метод сайт-направленного мутагенеза основан на репликации обеих цепей плазмидной ДНК с использованием мутагенных праймеров и высокоточной ДНК-полимеразы Pfu Ultra. В основу процедуры положена сверхспирализованная двухцепочечная ДНК-вектор (дцДНК) со вставкой, представляющей интерес, и два синтетических олигонуклеотидных праймера, каждый из которых содержит заданную мутацию и комплементарен одной из противоположных цепей вектора.

При температурном циклировании олигонуклеотидные праймеры удлиняются ДНК-полимеразой Hi-Proof производства HiMedia без вытеснения праймера. В результате образуется мутантная плазмида со ступенчатыми одноцепочечными разрывами.

Методика проведения мутагенеза

1. Подготовьте сверхспирализованную двухцепочечную ДНК-вектор со вставкой и два синтетических олигонуклеотидных праймера, содержащих заданную мутацию.
2. Проведите температурное циклирование для удлинения праймеров ДНК-полимеразой Hi-Proof и получения мутантной плазмиды со ступенчатыми одноцепочечными разрывами.
3. Обработайте продукт эндонуклеазой Dpn I. Фермент распознаёт целевую последовательность 5′-Gm⁶ATC-3′ и специфичен к метилированной и гемиметилированной ДНК; обработка используется для расщепления исходной матричной ДНК и отбора синтезированной ДНК, содержащей мутацию.
4. Трансформируйте содержащую мутацию ДНК вектора в компетентные клетки XL1-Blue.

ДНК, выделенная почти из всех штаммов E. coli, метилирована по dam-сайту и поэтому восприимчива к расщеплению Dpn I.

Назначение

Набор позволяет создавать целевые генетические изменения в заданных позициях. Удлинение праймеров применяют для сайт-направленной замены нуклеотидов и функционального анализа при белковой инженерии.